O tratamento secundário remove matéria orgânica solúvel, nutrientes como o azoto e o fósforo e a maioria dos sólidos suspensos que escapam ao tratamento primário. Na maioria das vezes, são utilizados processos biológicos nos quais os micróbios metabolizam compostos orgânicos e nutrientes para crescerem e se reproduzirem. Os dois tipos de processos de tratamento secundário biológico mais comuns são os sistemas de crescimento associado e de crescimento suspenso. Um processo de crescimento suspenso promove o crescimento de flocos suspensos de microrganismos a partir de organismos individuais já presentes nas águas residuais e na lama ativada de retorno. Os flocos contêm organismos capazes de remover os poluentes através de ambientes aeróbios, anóxicos e anaeróbios. Uma vez removidos os poluentes, os flocos são enviados para um processo de clarificação secundária, no qual se separam da água por ação da gravidade. Uma porção da lama no fundo do clarificador secundário é então direcionada de volta para montante, para se misturar com o efluente primário (lama ativada de retorno) para criar a mistura. A lama restante é removida do processo (lama ativada de resíduos) para criar a ecologia ideal de microrganismos. Os sistemas de crescimento associado dependem da associação dos microrganismos ao fluido e da criação de uma pelicula biológica. Os detritos alojados são misturados ou polvilhados sobre o fluido coberto pela película biológica, onde os microrganismos removem os poluentes. Tal como no processo de crescimento suspenso, os fragmentos de película biológica e os flocos suspensos são enviados para um clarificador secundário para separação, onde a lama é reciclada e a água limpa e residual é descarregada para o processo seguinte.
Para que o tratamento biológico funcione de forma eficiente, os organismos necessitam de nutrientes numa relação equilibrada, incluindo carbono, nitrogénio e fósforo (referenciados como C:N:P), bem como de oligoelementos como ferro, cobre, zinco, níquel, manganésio, potássio, enxofre e outros componentes que estão tipicamente presentes em águas residuais. A relação de C:N:P comumente aceite é de 100:5:1, embora algumas instalações prosperem fora desta relação, enquanto outras sofrem a formação de lodo de polissacarídeos ou o crescimento de bactérias filamentosas que inibem a biologia e o alojamento no clarificador secundário.
Podem ser empregues vários processos biológicos para concluir o tratamento secundário, incluindo bacias de arejamento de fluxo de pistão, tanques de aeração de mistura completa, reatores de conjuntos sequenciais, valas de oxidação, filtros biológicos, reatores de película biológica de leito móvel, lama ativada de película fixa e integrada e outros.
A remoção biológica de nutrientes (BNR) altera o ambiente dos microrganismos para remover nitrogénio e fósforo da água. Um processo BNR é composto pelas fases anaeróbia (sem oxigénio ou nitrato), anóxica (sem oxigénio, o nitrato está presente) e aeróbica (oxigénio presente), durante as quais a água é movida através de uma série de câmaras para realizar várias funções biológicas.
Podem também ser utilizados processos de tratamento químico, como a remoção química de fósforo. Ao introduzir um precipitante químico dentro da bacia de aeração e dos clarificadores, o fósforo é removido por floculação, unindo-se em compostos insolúveis que se alojam e que podem ser removidos como lama.